L'ornithorynque est un animal nocturne semi-aquatique. Il supporte mal la chaleur et passe la journée dans son terrier qu'il creuse dans les berges. Lorsqu'il chasse, il protège ses yeux et ses narines qui se ferment automatiquement. Pourtant, il ne peut rester bien longtemps sous l'eau sans respirer et doit donc remonter fréquemment à la surface pour récupérer. Ce mammifère est chassé par divers prédateurs comme les serpents, les rapaces, et on suspecte l'introduction des renards en Australie de jouer un rôle dans la diminution de leurs populations. La pollution de l'eau est un autre facteur de raréfaction de cet animal. L'ornithorynque mâle possède un territoire plus grand que les femelles, celle-ci étant englobées dans le territoire du mâle.
Détail de l'éperon du mâle Photo par Elonnon CC BY-SA 3.0
La reproduction a lieu entre juin et octobre (hiver austral). On suppose que ces animaux sont polygames. Toujours est-il que l'accouplement a lieu dans l'eau et que la femelle fécondée prépare un second terrier, plus haut et plus profond, ou elle pondra ses oeufs, entre 1 et 3. Le terrier est aménagé avec divers matériaux que la femelle transporte dans sa queue enroulée. Le mâle ne se préoccupe pas de ses petits. Au bout de 28 jours passés dans l'utérus, les oeufs sont pondus. Ils éclosent après 10 jours d'incubation. Les petits sont très fragiles, aveugles et sans poils. Leur mère les allaite, mais n'a pas de mamelles. Le lait suinte dans le pelage de la femelle par des pores et les jeunes le sucent. La mère s'absente rarement et fabrique de petits bouchons de terre dans la galerie du terrier en sortant, qu'elle détruit en revenant, afin de protéger sa progéniture. Les jeunes passent 4 mois dans le terrier sans en sortir. La maturité sexuelle est atteinte à l'âge de deux ans.
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